鱼鳞鱼皮制备胶原蛋白肽研究进展

表2 分离膜的种类及用途

Table 2 Types and uses of separation membrane

注：/表示孔径范围不一，可根据实际产品确定。

膜分离主要用于目标物质的分离截留和功能验证。Sonklin等利用超滤技术对粗分离的绿豆粕蛋白水解肽MMPH进行分级分离，得到4个部分，其中分子量小于1kDa的F4表现出最高的DPPH自由基、超氧化物及羟基自由基清除活性和金属螯合活性。膜分离也可以和液相色谱技术结合，用于目标物质的筛选和鉴定。Wang等对苍耳果实提取物利用超滤-高效液相色谱筛选出3种具有竞争性抑制酪氨酸酶的物质。Li等利用超滤-液相质谱法筛选和鉴定人参提取物α-葡萄糖苷酶抑制剂。

3.2 二级结构测定

肽的二级结构测定可采用远紫外圆二色谱。先将选取的目标肽加热到指定温度后进行恒温保持，然后进行紫外波长（190nm～250nm）扫描，该方法要求每个肽至少重复扫描两次，求其平均值，再利用Pro-Date Viewer、CDNN等软件测定构象。

3.3 表面结构观察

肽表面结构的观察可使用原子力显微镜观察（atomic force microscope，AFM），AFM可以直接测试物体表面，得到清晰度高、分辨率高的物体表面图像。由于AFM不受样品导电性能的影响，测试过程中对样品表面无损害，同时还可以获得样品颗粒厚度等信息，多用于观测粉末状样品的表面结构。AFM镜检可采用接触模式、非接触模式、轻敲模式及相位移模式观察。Tinazli等先利用接触模式AFM探针将已经吸附的蛋白质部分刮除得到图案化模板，再在模板上附着另外一种蛋白质，制备出功能性多蛋白复合体。甘田生利用AFM对大肠杆菌外膜孔蛋白OmpF三聚体脂质膜表面进行观察，观察到表面小突起是连接到β链上的短肽环（含有2个～3个氨基酸）。

3.4 空间结构解析

肽空间结构的解析多采用核磁共振法。Roch等利用核磁共振对抗菌肽Mytilin B结构进行研究，结果表明，Mytilin B分子结构是由4对二硫键将1段α-螺旋和2段β-折叠片稳定的特殊空间结构。此外，二维核磁共振（2D nuclear magnetic resonance，2DNMR）可将核磁共振中谱线强度、耦合常数及化学位移等参数表现在二维平面上，避免一维核磁中的信号重叠并且可以提供自旋核之间相互作用的信息，从分子水平分析肽的功能活性位点。

利用B16小鼠黑色瘤细胞可以验证鱼鳞鱼皮肽对黑色素的抑制情况。将B16小鼠黑色素瘤细胞接种于含双抗的达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）（dulbec－co’s modified eagle’s medium，DMEM）培养基，并置于二氧化碳培养箱中培养、消化传代。待细胞附着后，进行黑色素含量、酪氨酸酶活性等测定。高雅倩等在对α-促黑素诱导B16细胞模型中表明，棕榈酰三肽-5可以通过抑制酪氨酸酶活性降低黑色素水平。

4.2 鱼鳞鱼皮肽保湿功能的测定

成纤维细胞细胞增殖率、细胞透明质酸含量、胶原蛋白含量等指标能反映鱼鳞鱼皮肽的保湿功能。Sun等从罗非鱼皮中鉴定出3个关键肽段GYTGL、LGATGL和VLGL，该肽段可以有效降低胶原蛋白的降解并能抑制紫外诱导的成纤维细胞基质金属蛋白酶1（matrix metallopeptidase 1，MMP-1）活性氧簇（re－active oxygen species，ROS）活性，促进人体成纤维细胞增值。Okawa等水解胶原蛋白后得到Pro-Hyp、CysThr-Gly两种寡肽，该肽段具有明显提高成纤维细胞中透明质酸合成的作用。邵茜等通过MTT法比较了浓度为10μg/mL～1000μg/mL的鳕鱼皮胶原肽、海蜇胶原肽、牛骨胶原肽对光老化皮肤成纤维细胞的影响。结果表明，鳕鱼皮胶原肽组成纤维细胞的增殖率要高于海蜇胶原肽组和牛骨胶原肽组。

4.3 鱼鳞鱼皮肽对皮肤的改善作用

通过对大鼠皮肤弹性、蛋白质含量、羟脯氨酸（Hyp）含量、皮肤含水量、皮肤组织中MMP-1含量等进行测定，表明羟脯氨酸的含量可直接反映真皮内纤维含量，与皮肤衰老状况呈正相关。紫外线照射下皮肤中MMP-1含量升高导致胶原纤维合成受阻，胶原蛋白快速降解，皮肤弹性下降。Chen等通过小鼠实验得到平均分子量为1 200Da的鳕鱼皮胶原蛋白肽可以抑制MMP-1的活性，有改善小鼠皮肤的作用。